L'insediamento originario fu fondato dagli Umbri sulla riva sinistra del Tevere in prossimità del territorio assoggettato al controllo degli Etruschi; a partire dal III secolo a.C., a causa dell'espansione romana, la città fu federata di Roma e, successivamente, fu inserita nella Regio VI Umbria. Dal I secolo a.C. divenne municipio romano, di cui patrono più illustre fu Gaio Plinio Cecilio Secondo, detto Plinio il Giovane, il quale, secondo quanto affermato in una sua lettera, fece erigere un tempio, ultimato nel 103 a.C. o 104 a.C., di cui non si conosce la collocazione.
Certamente, la gens Plinia possedeva vasti latifondi nelle vicinanze della città ed una villa è più volte ricordata dallo stesso Plinio il Giovane, nelle sue lettere; gli scavi operati dall'Università degli studi di Perugia in collaborazione con l'Università di Alicante, in località Colle Plinio nel comune di San Giustino, hanno permesso di individuare la collocazione della villa di Plinio il Giovane. La città fu chiamata Tifernum Tiberinum dai Romani, al fine di distinguerla dall'omonimo insediamento posto sul Metauro, Tifernum Metaurense, e sembra che assunse una discreta rilevanza visto che è citata anche da Plinio il Vecchio.
Non è possibile, però, ricostruire con certezza la struttura urbanistica della città romana; sicuramente, però, la parte più antica della città corrisponde alla zona sud, dove, nel quartiere denominato Mattonata, sono stati rinvenuti alcuni mosaici, resti di strutture idrauliche e una porzione di muro di quello che con ogni probabilità doveva essere un anfiteatro.

Medioevo

Incerta è la datazione della diffusione del Cristianesimo, attribuita dalla tradizione a san Crescenziano, vissuto tra il III ed il IV secolo, che fu martirizzato a seguito di una condanna emessa proprio a Tifernum. Il primo vescovo di Tifernum Tiberinum, Eubodio, è documentato nell'anno 465.
Secondo la tradizione, la città fu distrutta nel VI secolo ad opera del goto Totila e successivamente ricostruita dal vescovo Florido, poi santificato e proclamato patrono della città. La città venne dunque conquistata dai Longobardi e denominata Castrum Felicitatis, per passare poi sotto il dominio dei Franchi prima e dello Stato della Chiesa poi.
Intorno al 1100 si organizzò in Comune e fu minacciata dalle pretese dell'Impero, dello Stato della Chiesa, di Firenze e di Perugia. Nella prima metà del 1200 fu denominata Civitas Castelli e, nonostante che le rivalità tra Guelfi e Ghibellini ne misero spesso in pericolo la libertà, poté ugualmente godere di prosperità. In questo periodo acquista indipendenza il borgo di Sansepolcro, sorto agli inizi dell'XI secolo attorno all'omonimo monastero nel contado di Città di Castello, e sviluppatosi in comune autonomo tra i secoli XII e XIII.